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Controlar el movimiento de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro para la administración dirigida de citostáticos.
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Centro Nacional de Investigación Médica Almazov del Ministerio de Salud de la Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa; 2 Universidad Electrotécnica de San Petersburgo “LETI”, San Petersburgo, 197376, Federación Rusa; 3 Centro de Medicina Personalizada, Centro Estatal de Investigación Médica Almazov, Ministerio de Salud de la Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa; 4FSBI “Instituto de Investigación de la Gripe que lleva el nombre de AA Smorodintsev”, Ministerio de Salud de la Federación Rusa, San Petersburgo, Federación Rusa; 5 Instituto Sechenov de Fisiología y Bioquímica Evolutiva, Academia Rusa de Ciencias, San Petersburgo, Federación Rusa; 6 Instituto de Citología RAS, San Petersburgo, 194064, Federación Rusa; 7INSERM U1231, Facultad de Medicina y Farmacia, Universidad de Bourgogne-Franche Comté de Dijon, Francia Comunicación: Yana ToropovaAlmazov Centro Nacional de Investigación Médica, Ministerio de Salud de la Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa Tel +7 981 95264800 4997069 Correo electrónico [email protected] Antecedentes: Un enfoque prometedor para el problema de la toxicidad citostática es el uso de nanopartículas magnéticas (MNP) para la administración dirigida de fármacos. Objetivo: Utilizar cálculos para determinar las mejores características del campo magnético que controla las MNP in vivo, y evaluar la eficiencia de la administración magnetrónica de MNP a tumores de ratón in vitro e in vivo. (MNP-ICG) se utiliza. Se realizaron estudios de intensidad de luminiscencia in vivo en ratones con tumores, con y sin un campo magnético en el sitio de interés. Estos estudios se llevaron a cabo en un andamio hidrodinámico desarrollado por el Instituto de Medicina Experimental del Centro Estatal de Investigación Médica Almazov del Ministerio de Salud de Rusia. Resultado: El uso de imanes de neodimio promovió la acumulación selectiva de MNP. Un minuto después de la administración de MNP-ICG a ratones con tumores, las MNP-ICG se acumularon principalmente en el hígado. En ausencia y presencia de un campo magnético, esto indica su vía metabólica. Si bien se observó un aumento de la fluorescencia en el tumor en presencia de un campo magnético, la intensidad de la fluorescencia en el hígado del animal no varió con el tiempo. Conclusión: Este tipo de MNP, combinado con la intensidad del campo magnético calculada, puede servir de base para el desarrollo de la administración controlada magnéticamente de fármacos citostáticos a tejidos tumorales. Palabras clave: análisis de fluorescencia, indocianina, nanopartículas de óxido de hierro, administración de citostáticos mediante magnetrón, focalización tumoral
Las enfermedades tumorales son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Al mismo tiempo, persiste la dinámica de aumento de la morbilidad y la mortalidad por enfermedades tumorales. 1 La quimioterapia utilizada hoy en día sigue siendo uno de los principales tratamientos para diferentes tumores. Sin embargo, el desarrollo de métodos para reducir la toxicidad sistémica de los citostáticos sigue siendo relevante. Un método prometedor para resolver su problema de toxicidad es el uso de nanotransportadores para dirigir la administración de fármacos, lo que permite la acumulación local de fármacos en los tejidos tumorales sin aumentar su concentración en órganos y tejidos sanos. 2 Este método permite mejorar la eficacia y la focalización de los fármacos quimioterapéuticos en los tejidos tumorales, al tiempo que se reduce su toxicidad sistémica.
Entre las diversas nanopartículas consideradas para la administración dirigida de agentes citostáticos, las nanopartículas magnéticas (NPM) son de particular interés debido a sus propiedades químicas, biológicas y magnéticas únicas, que garantizan su versatilidad. Por lo tanto, las nanopartículas magnéticas pueden utilizarse como sistema de calentamiento para tratar tumores con hipertermia (hipertermia magnética). También pueden utilizarse como agentes de diagnóstico (diagnóstico por resonancia magnética). 3-5 Utilizando estas características, combinadas con la posibilidad de acumulación de NPM en un área específica, mediante el uso de un campo magnético externo, la administración dirigida de preparados farmacéuticos abre la creación de un sistema magnetrónico multifuncional para dirigir los citostáticos al sitio del tumor. Perspectivas. Dicho sistema incluiría NPM y campos magnéticos para controlar su movimiento en el cuerpo. En este caso, tanto los campos magnéticos externos como los implantes magnéticos colocados en el área del cuerpo que contiene el tumor pueden utilizarse como fuente del campo magnético. 6 El primer método tiene serios inconvenientes, incluyendo la necesidad de utilizar equipo especializado para la administración magnética dirigida de fármacos y la necesidad de capacitar al personal para realizar la cirugía. Además, este método se ve limitado por su elevado coste y solo es adecuado para tumores superficiales cercanos a la superficie del cuerpo. El método alternativo de implantes magnéticos amplía el ámbito de aplicación de esta tecnología, facilitando su uso en tumores localizados en distintas partes del cuerpo. Tanto los imanes individuales como los integrados en el stent intraluminal pueden utilizarse como implantes para dañar tumores en órganos huecos y asegurar su permeabilidad. Sin embargo, según nuestra propia investigación no publicada, estos no son suficientemente magnéticos para garantizar la retención de las nanopartículas magnéticas fuera del torrente sanguíneo.
La eficacia de la administración de fármacos mediante magnetrón depende de muchos factores: las características del propio portador magnético y las de la fuente del campo magnético (incluidos los parámetros geométricos de los imanes permanentes y la intensidad del campo magnético que generan). El desarrollo de una tecnología eficaz de administración de inhibidores celulares guiada magnéticamente debe incluir el desarrollo de portadores de fármacos magnéticos a nanoescala adecuados, la evaluación de su seguridad y el desarrollo de un protocolo de visualización que permita monitorizar su movimiento en el organismo.
En este estudio, calculamos matemáticamente las características óptimas del campo magnético para controlar el transportador de fármacos a nanoescala magnético en el organismo. También se estudió la posibilidad de retener las nanopartículas magnéticas (NPM) a través de la pared del vaso sanguíneo bajo la influencia de un campo magnético aplicado con estas características computacionales en vasos sanguíneos aislados de rata. Además, sintetizamos conjugados de NPM y agentes fluorescentes y desarrollamos un protocolo para su visualización in vivo. En condiciones in vivo, en ratones modelo de tumores, se estudió la eficiencia de acumulación de las NPM en los tejidos tumorales cuando se administraron sistémicamente bajo la influencia de un campo magnético.
En el estudio in vitro, utilizamos la MNP de referencia, y en el estudio in vivo, utilizamos la MNP recubierta con poliéster de ácido láctico (ácido poliláctico, PLA) que contiene un agente fluorescente (indolecianina; ICG). La MNP-ICG se incluye en el caso de utilizar (MNP-PLA-EDA-ICG).
La síntesis y las propiedades físicas y químicas de las MNP se han descrito detalladamente en otras publicaciones. 7,8
Para sintetizar MNPs-ICG, primero se produjeron conjugados de PLA-ICG. Se utilizó una mezcla racémica en polvo de PLA-D y PLA-L con un peso molecular de 60 kDa.
Dado que tanto el PLA como el ICG son ácidos, para sintetizar conjugados PLA-ICG, primero se necesita sintetizar un espaciador con terminación amino en el PLA, que ayuda al ICG a quimisorberse al espaciador. El espaciador se sintetizó utilizando etilendiamina (EDA), el método de carbodiimida y la carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDAC). El espaciador PLA-EDA se sintetiza de la siguiente manera: agregar un exceso molar de 20 veces de EDA y un exceso molar de 20 veces de EDAC a 2 mL de solución de PLA en cloroformo de 0,1 g/mL. La síntesis se llevó a cabo en un tubo de ensayo de polipropileno de 15 mL en un agitador a una velocidad de 300 min-1 durante 2 horas. El esquema de síntesis se muestra en la Figura 1. Repetir la síntesis con un exceso de 200 veces de reactivos para optimizar el esquema de síntesis.
Al finalizar la síntesis, la solución se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos para eliminar el exceso de derivados de polietileno precipitados. A continuación, se añadieron 2 mL de una solución de ICG de 0,5 mg/mL en dimetilsulfóxido (DMSO) a la solución inicial. El agitador se mantuvo a una velocidad de 300 rpm durante 2 horas. El diagrama esquemático del conjugado obtenido se muestra en la Figura 2.
A 200 mg de MNP, añadimos 4 mL del conjugado PLA-EDA-ICG. Utilizamos un agitador LS-220 (LOIP, Rusia) para agitar la suspensión durante 30 minutos a una frecuencia de 300 min⁻¹. A continuación, se lavó con isopropanol tres veces y se sometió a separación magnética. Utilizamos un dispersor ultrasónico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusia) para añadir IPA a la suspensión durante 5-10 minutos bajo acción ultrasónica continua. Tras el tercer lavado con IPA, el precipitado se lavó con agua destilada y se resuspendió en solución salina fisiológica a una concentración de 2 mg/mL.
Se utilizó el equipo ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Reino Unido) para estudiar la distribución de tamaño de las nanopartículas magnéticas (NPM) obtenidas en la solución acuosa. Se empleó un microscopio electrónico de transmisión (TEM) con un cátodo de emisión de campo STEM JEM-1400 (JEOL, Japón) para estudiar la forma y el tamaño de las NPM.
En este estudio, utilizamos imanes permanentes cilíndricos (grado N35; con recubrimiento protector de níquel) y los siguientes tamaños estándar (longitud del eje mayor × diámetro del cilindro): 0,5 × 2 mm, 2 × 2 mm, 3 × 2 mm y 5 × 2 mm.
El estudio in vitro del transporte de MNP en el sistema modelo se llevó a cabo en un andamio hidrodinámico desarrollado por el Instituto de Medicina Experimental del Centro Estatal de Investigación Médica Almazov del Ministerio de Salud de Rusia. El volumen del líquido circulante (agua destilada o solución de Krebs-Henseleit) es de 225 mL. Se utilizan imanes cilíndricos magnetizados axialmente como imanes permanentes. Coloque el imán en un soporte a 1,5 mm de la pared interior del tubo de vidrio central, con su extremo orientado hacia la dirección del tubo (vertical). El caudal de fluido en el circuito cerrado es de 60 L/h (correspondiente a una velocidad lineal de 0,225 m/s). Se utiliza la solución de Krebs-Henseleit como fluido circulante porque es un análogo del plasma. El coeficiente de viscosidad dinámica del plasma es de 1,1–1,3 mPa∙s. 9 La cantidad de MNP adsorbida en el campo magnético se determina por espectrofotometría a partir de la concentración de hierro en el líquido circulante después del experimento.
Además, se han realizado estudios experimentales en una mesa de mecánica de fluidos mejorada para determinar la permeabilidad relativa de los vasos sanguíneos. Los componentes principales del soporte hidrodinámico se muestran en la Figura 3. Los componentes principales del stent hidrodinámico son un circuito cerrado que simula la sección transversal del sistema vascular modelo y un tanque de almacenamiento. El movimiento del fluido modelo a lo largo del contorno del módulo del vaso sanguíneo se realiza mediante una bomba peristáltica. Durante el experimento, se mantiene la vaporización y el rango de temperatura requerido, y se monitorean los parámetros del sistema (temperatura, presión, caudal de líquido y pH).
Figura 3 Diagrama de bloques del montaje utilizado para estudiar la permeabilidad de la pared de la arteria carótida. 1-tanque de almacenamiento, 2-bomba peristáltica, 3-mecanismo para introducir la suspensión que contiene MNP en el circuito, 4-caudalímetro, 5-sensor de presión en el circuito, 6-intercambiador de calor, 7-cámara con contenedor, 8-fuente del campo magnético, 9-globo con hidrocarburos.
La cámara que contiene el contenedor consta de tres contenedores: un contenedor exterior grande y dos contenedores pequeños, a través de los cuales pasan los brazos del circuito central. La cánula se inserta en el contenedor pequeño, se sujeta al contenedor pequeño y la punta de la cánula se ata firmemente con un alambre fino. El espacio entre el contenedor grande y el pequeño se llena con agua destilada, y la temperatura se mantiene constante gracias a la conexión con el intercambiador de calor. El espacio en el contenedor pequeño se llena con solución de Krebs-Henseleit para mantener la viabilidad de las células de los vasos sanguíneos. El tanque también se llena con solución de Krebs-Henseleit. El sistema de suministro de gas (carbono) se utiliza para vaporizar la solución en el contenedor pequeño dentro del tanque de almacenamiento y la cámara que contiene el contenedor (Figura 4).
Figura 4. Cámara donde se coloca el recipiente. 1-Cánula para descender los vasos sanguíneos, 2-Cámara exterior, 3-Cámara pequeña. La flecha indica la dirección del fluido del modelo.
Para determinar el índice de permeabilidad relativa de la pared del vaso, se utilizó la arteria carótida de la rata.
La introducción de la suspensión de MNP (0,5 mL) en el sistema presenta las siguientes características: el volumen interno total del tanque y el tubo de conexión en el circuito es de 20 mL, y el volumen interno de cada cámara es de 120 mL. La fuente de campo magnético externo es un imán permanente de tamaño estándar de 2 × 3 mm. Está instalado sobre una de las cámaras pequeñas, a 1 cm del recipiente, con un extremo orientado hacia la pared del recipiente. La temperatura se mantiene a 37 °C. La potencia de la bomba de rodillos se ajusta al 50 %, lo que corresponde a una velocidad de 17 cm/s. Como control, se tomaron muestras en una celda sin imanes permanentes.
Una hora después de la administración de una concentración determinada de MNP, se tomó una muestra líquida de la cámara. La concentración de partículas se midió mediante un espectrofotómetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, EE. UU.). Teniendo en cuenta el espectro de absorción de la suspensión de MNP, la medición se realizó a 450 nm.
De acuerdo con las directrices Rus-LASA-FELASA, todos los animales se crían en instalaciones libres de patógenos específicos. Este estudio cumple con todas las normativas éticas pertinentes para la experimentación e investigación con animales y ha obtenido la aprobación ética del Centro Nacional de Investigación Médica Almazov (IACUC). Los animales bebieron agua a voluntad y se alimentaron regularmente.
El estudio se realizó con 10 ratones NSG machos inmunodeficientes de 12 semanas de edad (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, EE. UU.), anestesiados y con un peso de 22 g ± 10 %. Dado que la inmunidad de los ratones inmunodeficientes está suprimida, esta línea permite el trasplante de células y tejidos humanos sin rechazo. Los hermanos de camada de diferentes jaulas se asignaron aleatoriamente al grupo experimental y se criaron juntos o se expusieron sistemáticamente a la cama de otros grupos para asegurar una exposición equitativa a la microbiota común.
La línea celular de cáncer humano HeLa se utiliza para establecer un modelo de xenoinjerto. Las células se cultivaron en DMEM que contenía glutamina (PanEco, Rusia), suplementado con 10 % de suero fetal bovino (Hyclone, EE. UU.), 100 UFC/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. La línea celular fue amablemente proporcionada por el Laboratorio de Regulación de la Expresión Génica del Instituto de Investigación Celular de la Academia Rusa de Ciencias. Antes de la inyección, las células HeLa se separaron del plástico de cultivo con una solución de tripsina:Versene 1:1 (Biolot, Rusia). Después del lavado, las células se suspendieron en medio completo a una concentración de 5 × 10⁶ células por 200 μl y se diluyeron con matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, en hielo). La suspensión celular preparada se inyectó subcutáneamente en la piel del muslo del ratón. Se utilizó un calibrador electrónico para monitorizar el crecimiento del tumor cada 3 días.
Cuando el tumor alcanzó los 500 mm³, se implantó un imán permanente en el tejido muscular del animal experimental cerca del tumor. En el grupo experimental (MNP-ICG + tumor-M), se inyectó 0,1 mL de suspensión de MNP y se expuso a un campo magnético. Se utilizaron animales enteros no tratados como controles (fondo). Además, se utilizaron animales a los que se les inyectó 0,1 mL de MNP pero no se les implantaron imanes (MNP-ICG + tumor-BM).
La visualización por fluorescencia de muestras in vivo e in vitro se realizó con el bioimagenador IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc., EE. UU.). Para la visualización in vitro, se añadió un volumen de 1 ml del conjugado sintético PLA-EDA-ICG y MNP-PLA-EDA-ICG a los pocillos de la placa. Teniendo en cuenta las características de fluorescencia del colorante ICG, se seleccionó el filtro óptimo para determinar la intensidad luminosa de la muestra: la longitud de onda de excitación máxima es de 745 nm y la de emisión de 815 nm. El software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) se utilizó para medir cuantitativamente la intensidad de fluorescencia de los pocillos que contenían el conjugado.
La intensidad de fluorescencia y la acumulación del conjugado MNP-PLA-EDA-ICG se midieron en ratones modelo tumoral in vivo, sin la presencia ni aplicación de un campo magnético en el sitio de interés. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y luego se inyectó 0,1 mL del conjugado MNP-PLA-EDA-ICG a través de la vena de la cola. Se utilizaron ratones no tratados como control negativo para obtener un fondo fluorescente. Después de administrar el conjugado por vía intravenosa, coloque al animal en una plataforma de calentamiento (37 °C) en la cámara del generador de imágenes de fluorescencia IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc.) mientras mantiene la anestesia por inhalación con isoflurano al 2 %. Utilice el filtro incorporado del ICG (745–815 nm) para la detección de la señal 1 minuto y 15 minutos después de la introducción de MNP.
Para evaluar la acumulación del conjugado en el tumor, se cubrió el área peritoneal del animal con papel, lo que permitió eliminar la intensa fluorescencia asociada a la acumulación de partículas en el hígado. Tras estudiar la biodistribución de MNP-PLA-EDA-ICG, los animales fueron sacrificados humanitariamente mediante una sobredosis de anestesia con isoflurano para la posterior separación de las áreas tumorales y la evaluación cuantitativa de la radiación de fluorescencia. Se utilizó el software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para procesar manualmente el análisis de la señal de la región de interés seleccionada. Se tomaron tres mediciones por cada animal (n = 9).
En este estudio, no cuantificamos la carga exitosa de ICG en las MNP-ICG. Además, no comparamos la eficiencia de retención de las nanopartículas bajo la influencia de imanes permanentes de diferentes formas. Asimismo, no evaluamos el efecto a largo plazo del campo magnético sobre la retención de las nanopartículas en los tejidos tumorales.
Predominan las nanopartículas, con un tamaño promedio de 195,4 nm. Además, la suspensión contenía aglomerados con un tamaño promedio de 1176,0 nm (Figura 5A). Posteriormente, la muestra se filtró mediante un filtro centrífugo. El potencial zeta de las partículas es de -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5 Propiedades físicas de la suspensión: (A) distribución del tamaño de partícula; (B) distribución de partículas en el potencial zeta; (C) fotografía TEM de nanopartículas.
El tamaño de partícula es básicamente de 200 nm (Figura 5C), compuesto por una única nanopartícula magnética (MNP) de 20 nm y una capa orgánica conjugada de PLA-EDA-ICG con menor densidad electrónica. La formación de aglomerados en soluciones acuosas se explica por el módulo relativamente bajo de la fuerza electromotriz de las nanopartículas individuales.
Para imanes permanentes, cuando la magnetización se concentra en el volumen V, la expresión integral se divide en dos integrales, a saber, el volumen y la superficie:
En el caso de una muestra con magnetización constante, la densidad de corriente es cero. Entonces, la expresión del vector de inducción magnética tomará la siguiente forma:
Utilice el programa MATLAB (MathWorks, Inc., EE. UU.) para los cálculos numéricos, con licencia académica ETU “LETI” número 40502181.
Como se muestra en las figuras 7, 8, 9 y 10, el campo magnético más intenso se genera mediante un imán orientado axialmente desde el extremo del cilindro. El radio de acción efectivo es equivalente a la geometría del imán. En imanes cilíndricos con un cilindro cuya longitud es mayor que su diámetro, el campo magnético más intenso se observa en la dirección axial-radial (para el componente correspondiente); por lo tanto, un par de cilindros con una mayor relación de aspecto (diámetro y longitud) permite la adsorción de MNP de forma más eficaz.
Figura 7. Componente de la intensidad de inducción magnética Bz a lo largo del eje Oz del imán; tamaño estándar del imán: línea negra 0,5×2 mm, línea azul 2×2 mm, línea verde 3×2 mm, línea roja 5×2 mm.
Figura 8 El componente de inducción magnética Br es perpendicular al eje del imán Oz; el tamaño estándar del imán: línea negra 0,5×2 mm, línea azul 2×2 mm, línea verde 3×2 mm, línea roja 5×2 mm.
Figura 9. Componente Bz de la intensidad de inducción magnética a una distancia r del eje final del imán (z=0); tamaño estándar del imán: línea negra 0,5×2 mm, línea azul 2×2 mm, línea verde 3×2 mm, línea roja 5×2 mm.
Figura 10 Componente de inducción magnética en la dirección radial; tamaño estándar del imán: línea negra 0,5×2 mm, línea azul 2×2 mm, línea verde 3×2 mm, línea roja 5×2 mm.
Se pueden utilizar modelos hidrodinámicos especiales para estudiar el método de administración de nanopartículas magnéticas (NPM) a tejidos tumorales, concentrarlas en la zona objetivo y determinar su comportamiento en condiciones hidrodinámicas dentro del sistema circulatorio. Los imanes permanentes pueden utilizarse como campos magnéticos externos. Si se ignora la interacción magnetostática entre las nanopartículas y no se considera el modelo de fluido magnético, basta con estimar la interacción entre el imán y una sola nanopartícula mediante una aproximación dipolo-dipolo.
Donde m es el momento magnético del imán, r es el vector de posición del punto donde se ubica la nanopartícula y k es el factor del sistema. En la aproximación dipolar, el campo del imán tiene una configuración similar (Figura 11).
En un campo magnético uniforme, las nanopartículas solo giran a lo largo de las líneas de fuerza. En un campo magnético no uniforme, actúa sobre ellas una fuerza:
¿Dónde se encuentra la derivada de una dirección l dada? Además, la fuerza atrae las nanopartículas hacia las áreas más irregulares del campo, es decir, la curvatura y la densidad de las líneas de fuerza aumentan.
Por lo tanto, es conveniente utilizar un imán (o cadena de imanes) suficientemente potente con una anisotropía axial evidente en la zona donde se encuentran las partículas.
La Tabla 1 muestra la capacidad de un solo imán como fuente de campo magnético suficiente para capturar y retener nanopartículas magnéticas en el lecho vascular del campo de aplicación.