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Controle el movimiento de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro para la administración dirigida de citostáticos
Autor Toropova Y, Korolev D, Istomina M, Shulmeyster G, Petukhov A, Mishanin V, Gorshkov A, Podyacheva E, Gareev K, Bagrov A, Demidov O
Yana Toropova,1 Dmitry Korolev,1 Maria Istomina,1,2 Galina Shulmeyster,1 Alexey Petukhov,1,3 Vladimir Mishanin,1 Andrey Gorshkov,4 Ekaterina Podyacheva,1 Kamil Gareev,2 Alexei Bagrov,5 Oleg Demidov6,71Almazov National Medical Centro de Investigación del Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, San Petersburgo, 197341, Federación de Rusia;2 Universidad Electrotécnica de San Petersburgo “LETI”, San Petersburgo, 197376, Federación de Rusia;3 Centro de Medicina Personalizada, Centro Estatal de Investigaciones Médicas de Almazov, Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, San Petersburgo, 197341, Federación de Rusia;4FSBI “Instituto de Investigación sobre la Influenza que lleva el nombre de AA Smorodintsev” Ministerio de Salud de la Federación de Rusia, San Petersburgo, Federación de Rusia;5 Instituto Sechenov de Fisiología Evolutiva y Bioquímica, Academia de Ciencias de Rusia, San Petersburgo (Federación de Rusia);6 Instituto de Citología RAS, San Petersburgo, 194064, Federación de Rusia;7INSERM U1231, Facultad de Medicina y Farmacia, Universidad Bourgogne-Franche Comté de Dijon, Francia Comunicación: Yana ToropovaAlmazov Centro Nacional de Investigaciones Médicas, Ministerio de Salud de la Federación Rusa, San Petersburgo, 197341, Federación Rusa Tel +7 981 95264800 4997069 Correo electrónico [email protected] Antecedentes: un enfoque prometedor para el problema de la toxicidad citostática es el uso de nanopartículas magnéticas (MNP) para la administración dirigida de fármacos.Propósito: Utilizar cálculos para determinar las mejores características del campo magnético que controla las MNP in vivo y evaluar la eficiencia de la administración de MNP con magnetrón a tumores de ratón in vitro e in vivo.(MNPs-ICG).Se realizaron estudios de intensidad de luminiscencia in vivo en ratones con tumores, con y sin campo magnético en el sitio de interés.Estos estudios se llevaron a cabo en un andamio hidrodinámico desarrollado por el Instituto de Medicina Experimental del Centro Estatal de Investigación Médica de Almazov del Ministerio de Salud de Rusia.Resultado: El uso de imanes de neodimio promovió la acumulación selectiva de MNP.Un minuto después de la administración de MNPs-ICG a ratones con tumores, MNPs-ICG se acumula principalmente en el hígado.En ausencia y presencia de un campo magnético, esto indica su vía metabólica.Aunque se observó un aumento de la fluorescencia en el tumor en presencia de un campo magnético, la intensidad de la fluorescencia en el hígado del animal no cambió con el tiempo.Conclusión: Este tipo de MNP, combinado con la intensidad del campo magnético calculada, puede ser la base para el desarrollo de la administración controlada magnéticamente de fármacos citostáticos a los tejidos tumorales.Palabras clave: análisis de fluorescencia, indocianina, nanopartículas de óxido de hierro, administración de citostáticos con magnetrón, focalización de tumores
Las enfermedades tumorales son una de las principales causas de muerte en todo el mundo.Al mismo tiempo, todavía existe una dinámica de creciente morbilidad y mortalidad por enfermedades tumorales.1 La quimioterapia utilizada hoy en día sigue siendo uno de los principales tratamientos para diferentes tumores.Al mismo tiempo, sigue siendo relevante el desarrollo de métodos para reducir la toxicidad sistémica de los citostáticos.Un método prometedor para resolver su problema de toxicidad es utilizar portadores a nanoescala para atacar los métodos de administración de fármacos, que pueden proporcionar una acumulación local de fármacos en tejidos tumorales sin aumentar su acumulación en órganos y tejidos sanos.concentración.2 Este método permite mejorar la eficacia y la focalización de los fármacos quimioterapéuticos en los tejidos tumorales, al tiempo que reduce su toxicidad sistémica.
Entre las diversas nanopartículas consideradas para la administración dirigida de agentes citostáticos, las nanopartículas magnéticas (MNP) son de particular interés debido a sus propiedades químicas, biológicas y magnéticas únicas, que garantizan su versatilidad.Por tanto, las nanopartículas magnéticas se pueden utilizar como sistema de calentamiento para tratar tumores con hipertermia (hipertermia magnética).También se pueden utilizar como agentes de diagnóstico (diagnóstico por resonancia magnética).3-5 Utilizando estas características, combinadas con la posibilidad de acumulación de MNP en un área específica, mediante el uso de un campo magnético externo, la administración de preparaciones farmacéuticas dirigidas abre la creación de un sistema de magnetrón multifuncional para dirigir los citostáticos al sitio del tumor. Perspectivas.Un sistema de este tipo incluiría MNP y campos magnéticos para controlar su movimiento en el cuerpo.En este caso, como fuente del campo magnético se pueden utilizar tanto campos magnéticos externos como implantes magnéticos colocados en la zona del cuerpo que contiene el tumor.6 El primer método tiene serias deficiencias, incluida la necesidad de utilizar equipos especializados para la orientación magnética de los medicamentos y la necesidad de capacitar al personal para realizar cirugías.Además, este método está limitado por su alto coste y sólo es adecuado para tumores "superficiales" cercanos a la superficie del cuerpo.El método alternativo de utilizar implantes magnéticos amplía el ámbito de aplicación de esta tecnología, facilitando su uso en tumores ubicados en diferentes partes del cuerpo.Tanto los imanes individuales como los imanes integrados en el stent intraluminal se pueden utilizar como implantes para daños tumorales en órganos huecos para garantizar su permeabilidad.Sin embargo, según nuestra propia investigación no publicada, estos no son lo suficientemente magnéticos como para asegurar la retención de MNP del torrente sanguíneo.
La eficacia de la administración de fármacos con magnetrón depende de muchos factores: las características del propio portador magnético y las características de la fuente del campo magnético (incluidos los parámetros geométricos de los imanes permanentes y la intensidad del campo magnético que generan).El desarrollo de una tecnología exitosa de administración de inhibidores celulares guiados magnéticamente debería implicar el desarrollo de portadores de fármacos magnéticos a nanoescala apropiados, la evaluación de su seguridad y el desarrollo de un protocolo de visualización que permita rastrear sus movimientos en el cuerpo.
En este estudio, calculamos matemáticamente las características óptimas del campo magnético para controlar el portador magnético de fármacos a nanoescala en el cuerpo.También se estudió en vasos sanguíneos aislados de ratas la posibilidad de retener MNP a través de la pared de los vasos sanguíneos bajo la influencia de un campo magnético aplicado con estas características computacionales.Además, sintetizamos conjugados de MNP y agentes fluorescentes y desarrollamos un protocolo para su visualización in vivo.En condiciones in vivo, en ratones modelo de tumores, se estudió la eficiencia de acumulación de MNP en tejidos tumorales cuando se administran sistémicamente bajo la influencia de un campo magnético.
En el estudio in vitro utilizamos el MNP de referencia y en el estudio in vivo utilizamos el MNP recubierto con poliéster de ácido láctico (ácido poliláctico, PLA) que contiene un agente fluorescente (indolecianina; ICG).MNP-ICG está incluido en En el caso, utilice (MNP-PLA-EDA-ICG).
La síntesis y las propiedades físicas y químicas de MNP se han descrito en detalle en otra parte.7,8
Para sintetizar MNP-ICG, primero se produjeron conjugados PLA-ICG.Se utilizó una mezcla racémica en polvo de PLA-D y PLA-L con un peso molecular de 60 kDa.
Dado que PLA e ICG son ácidos, para sintetizar conjugados PLA-ICG, primero es necesario sintetizar un espaciador terminado en amino en PLA, que ayuda a que el ICG se quimiosorba al espaciador.El espaciador se sintetizó utilizando etilendiamina (EDA), método de carbodiimida y carbodiimida soluble en agua, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDAC).El espaciador PLA-EDA se sintetiza de la siguiente manera.Agregue un exceso molar de 20 veces de EDA y un exceso molar de 20 veces de EDAC a 2 ml de solución de cloroformo PLA de 0,1 g/ml.La síntesis se realizó en un tubo de ensayo de polipropileno de 15 mL en un agitador a una velocidad de 300 min-1 durante 2 horas.El esquema de síntesis se muestra en la Figura 1. Repita la síntesis con un exceso de reactivos de 200 veces para optimizar el esquema de síntesis.
Al final de la síntesis, la solución se centrifugó a una velocidad de 3000 min-1 durante 5 minutos para eliminar el exceso de derivados de polietileno precipitados.Luego, se añadieron 2 ml de una solución de ICG de 0,5 mg/ml en dimetilsulfóxido (DMSO) a los 2 ml de solución.El agitador se fija a una velocidad de agitación de 300 min-1 durante 2 horas.El diagrama esquemático del conjugado obtenido se muestra en la Figura 2.
En 200 mg de MNP, agregamos 4 ml de conjugado PLA-EDA-ICG.Utilice un agitador LS-220 (LOIP, Rusia) para agitar la suspensión durante 30 minutos a una frecuencia de 300 min-1.Luego, se lavó con isopropanol tres veces y se sometió a separación magnética.Utilice el dispersor ultrasónico UZD-2 (FSUE NII TVCH, Rusia) para agregar IPA a la suspensión durante 5 a 10 minutos bajo acción ultrasónica continua.Después del tercer lavado con IPA, el precipitado se lavó con agua destilada y se resuspendió en solución salina fisiológica a una concentración de 2 mg/ml.
Se utilizó el equipo ZetaSizer Ultra (Malvern Instruments, Reino Unido) para estudiar la distribución de tamaños de las MNP obtenidas en la solución acuosa.Se utilizó un microscopio electrónico de transmisión (TEM) con un cátodo de emisión de campo STEM JEM-1400 (JEOL, Japón) para estudiar la forma y el tamaño del MNP.
En este estudio, utilizamos imanes permanentes cilíndricos (grado N35; con capa protectora de níquel) y los siguientes tamaños estándar (longitud del eje largo × diámetro del cilindro): 0,5×2 mm, 2×2 mm, 3×2 mm y 5×2 mm.
El estudio in vitro del transporte de MNP en el sistema modelo se llevó a cabo en un andamio hidrodinámico desarrollado por el Instituto de Medicina Experimental del Centro Estatal de Investigación Médica de Almazov del Ministerio de Salud de Rusia.El volumen del líquido circulante (agua destilada o solución de Krebs-Henseleit) es de 225 ml.Como imanes permanentes se utilizan imanes cilíndricos magnetizados axialmente.Coloque el imán en un soporte a 1,5 mm de la pared interior del tubo de vidrio central, con su extremo orientado en la dirección del tubo (vertical).El caudal de fluido en el circuito cerrado es de 60 L/h (correspondiente a una velocidad lineal de 0,225 m/s).La solución de Krebs-Henseleit se utiliza como líquido circulante porque es análoga al plasma.El coeficiente de viscosidad dinámica del plasma es de 1,1 a 1,3 mPa∙s.9 La cantidad de MNP adsorbida en el campo magnético se determina mediante espectrofotometría a partir de la concentración de hierro en el líquido circulante después del experimento.
Además, se han llevado a cabo estudios experimentales sobre una mesa de mecánica de fluidos mejorada para determinar la permeabilidad relativa de los vasos sanguíneos.Los componentes principales del soporte hidrodinámico se muestran en la Figura 3. Los componentes principales del stent hidrodinámico son un circuito cerrado que simula la sección transversal del sistema vascular modelo y un tanque de almacenamiento.El movimiento del líquido modelo a lo largo del contorno del módulo de vasos sanguíneos lo proporciona una bomba peristáltica.Durante el experimento, mantenga la vaporización y el rango de temperatura requerido, y controle los parámetros del sistema (temperatura, presión, caudal de líquido y valor de pH).
Figura 3 Diagrama de bloques del montaje utilizado para estudiar la permeabilidad de la pared de la arteria carótida.1-tanque de almacenamiento, 2-bomba peristáltica, 3-mecanismo para introducir la suspensión que contiene MNP en el circuito, 4-medidor de flujo, 5-sensor de presión en el circuito, 6-intercambiador de calor, 7-cámara con contenedor, 8-la fuente del campo magnético, 9-el globo con hidrocarburos.
La cámara que contiene el contenedor consta de tres contenedores: un contenedor exterior grande y dos contenedores pequeños, por los que pasan los brazos del circuito central.La cánula se inserta en el recipiente pequeño, el recipiente se ensarta en el recipiente pequeño y la punta de la cánula se ata firmemente con un alambre delgado.El espacio entre el recipiente grande y el pequeño se llena con agua destilada y la temperatura se mantiene constante gracias a la conexión al intercambiador de calor.El espacio del recipiente pequeño se llena con solución de Krebs-Henseleit para mantener la viabilidad de las células de los vasos sanguíneos.El tanque también se llena con solución de Krebs-Henseleit.El sistema de suministro de gas (carbono) se utiliza para vaporizar la solución en el recipiente pequeño en el tanque de almacenamiento y la cámara que contiene el recipiente (Figura 4).
Figura 4 La cámara donde se coloca el contenedor.1-Cánula para bajar los vasos sanguíneos, 2-Cámara exterior, 3-Cámara pequeña.La flecha indica la dirección del fluido modelo.
Para determinar el índice de permeabilidad relativa de la pared del vaso se utilizó la arteria carótida de rata.
La introducción de la suspensión MNP (0,5 ml) en el sistema tiene las siguientes características: el volumen interno total del tanque y la tubería de conexión en el circuito es de 20 ml y el volumen interno de cada cámara es de 120 ml.La fuente externa del campo magnético es un imán permanente con un tamaño estándar de 2×3 mm.Se instala encima de una de las cámaras pequeñas, a 1 cm de distancia del contenedor, con un extremo hacia la pared del contenedor.La temperatura se mantiene a 37°C.La potencia de la bomba de rodillos se ajusta al 50%, lo que corresponde a una velocidad de 17 cm/s.Como control, las muestras se tomaron en una celda sin imanes permanentes.
Una hora después de la administración de una determinada concentración de MNP, se tomó una muestra líquida de la cámara.La concentración de partículas se midió mediante un espectrofotómetro utilizando un espectrofotómetro UV-Vis Unico 2802S (United Products & Instruments, EE. UU.).Teniendo en cuenta el espectro de absorción de la suspensión de MNP, la medición se realizó a 450 nm.
Según las directrices Rus-LASA-FELASA, todos los animales son criados y criados en instalaciones específicas libres de patógenos.Este estudio cumple con todas las regulaciones éticas relevantes para experimentos e investigaciones con animales, y ha obtenido la aprobación ética del Centro Nacional de Investigación Médica de Almazov (IACUC).Los animales bebieron agua ad libitum y se alimentaron regularmente.
El estudio se realizó en 10 ratones NSG macho inmunodeficientes de 12 semanas de edad anestesiados (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/Szj, Jackson Laboratory, EE. UU.) 10, con un peso de 22 g ± 10%.Dado que la inmunidad de los ratones con inmunodeficiencia está suprimida, los ratones con inmunodeficiencia de esta línea permiten el trasplante de células y tejidos humanos sin rechazo del trasplante.Los compañeros de camada de diferentes jaulas fueron asignados aleatoriamente al grupo experimental y fueron criados conjuntamente o expuestos sistemáticamente a la ropa de cama de otros grupos para garantizar una exposición equitativa a la microbiota común.
La línea celular de cáncer humano HeLa se utiliza para establecer un modelo de xenoinjerto.Las células se cultivaron en DMEM que contenía glutamina (PanEco, Rusia), suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Hyclone, EE. UU.), 100 UFC/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.La línea celular fue proporcionada amablemente por el Laboratorio de Regulación de la Expresión Génica del Instituto de Investigación Celular de la Academia de Ciencias de Rusia.Antes de la inyección, las células HeLa se retiraron del plástico de cultivo con una solución de tripsina:Verseno 1:1 (Biolot, Rusia).Después del lavado, las células se suspendieron en medio completo a una concentración de 5 x 106 células por 200 μl y se diluyeron con matriz de membrana basal (LDEV-FREE, MATRIGEL® CORNING®) (1:1, en hielo).La suspensión celular preparada se inyectó por vía subcutánea en la piel del muslo del ratón.Utilice calibradores electrónicos para controlar el crecimiento del tumor cada 3 días.
Cuando el tumor alcanzó los 500 mm3, se implantó un imán permanente en el tejido muscular del animal de experimentación cerca del tumor.En el grupo experimental (MNPs-ICG + tumor-M), se inyectaron 0,1 ml de suspensión de MNP y se expusieron a un campo magnético.Se utilizaron animales enteros no tratados como controles (fondo).Además, se utilizaron animales a los que se les inyectó 0,1 ml de MNP pero no se les implantaron imanes (MNPs-ICG + tumor-BM).
La visualización de fluorescencia de muestras in vivo e in vitro se realizó en el bioimager IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc., EE. UU.).Para la visualización in vitro, se añadió a los pocillos de la placa un volumen de 1 ml de conjugado sintético PLA-EDA-ICG y MNP-PLA-EDA-ICG.Teniendo en cuenta las características de fluorescencia del tinte ICG, se selecciona el mejor filtro utilizado para determinar la intensidad luminosa de la muestra: la longitud de onda de excitación máxima es 745 nm y la longitud de onda de emisión es 815 nm.Se utilizó el software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para medir cuantitativamente la intensidad de fluorescencia de los pocillos que contienen el conjugado.
La intensidad de fluorescencia y la acumulación del conjugado MNP-PLA-EDA-ICG se midieron en ratones modelo tumoral in vivo, sin la presencia y aplicación de un campo magnético en el sitio de interés.Los ratones fueron anestesiados con isoflurano y luego se inyectaron 0,1 ml de conjugado MNP-PLA-EDA-ICG a través de la vena de la cola.Se utilizaron ratones no tratados como control negativo para obtener un fondo fluorescente.Después de administrar el conjugado por vía intravenosa, coloque al animal en una etapa de calentamiento (37 ° C) en la cámara del generador de imágenes de fluorescencia IVIS Lumina LT serie III (PerkinElmer Inc.) mientras mantiene la inhalación con anestesia con isoflurano al 2%.Utilice el filtro incorporado de ICG (745–815 nm) para la detección de señales 1 minuto y 15 minutos después de la introducción de MNP.
Para evaluar la acumulación de conjugado en el tumor, se cubrió la zona peritoneal del animal con papel, lo que permitió eliminar la fluorescencia brillante asociada a la acumulación de partículas en el hígado.Después de estudiar la biodistribución de MNP-PLA-EDA-ICG, los animales fueron sacrificados humanamente mediante una sobredosis de anestesia con isoflurano para la posterior separación de las áreas tumorales y la evaluación cuantitativa de la radiación fluorescente.Utilice el software Living Image 4.5.5 (PerkinElmer Inc.) para procesar manualmente el análisis de la señal de la región de interés seleccionada.Se tomaron tres medidas para cada animal (n = 9).
En este estudio, no cuantificamos la carga exitosa de ICG en MNP-ICG.Además, no comparamos la eficiencia de retención de nanopartículas bajo la influencia de imanes permanentes de diferentes formas.Además, no evaluamos el efecto a largo plazo del campo magnético sobre la retención de nanopartículas en tejidos tumorales.
Predominan las nanopartículas, con un tamaño medio de 195,4 nm.Además, la suspensión contenía aglomerados con un tamaño promedio de 1176,0 nm (Figura 5A).Posteriormente, la porción se filtró a través de un filtro centrífugo.El potencial zeta de las partículas es -15,69 mV (Figura 5B).
Figura 5 Las propiedades físicas de la suspensión: (A) distribución del tamaño de partículas;(B) distribución de partículas en potencial zeta;(C) Fotografía TEM de nanopartículas.
El tamaño de partícula es básicamente de 200 nm (Figura 5C), compuesto por un único MNP con un tamaño de 20 nm y una capa orgánica conjugada PLA-EDA-ICG con una menor densidad electrónica.La formación de aglomerados en soluciones acuosas puede explicarse por el módulo relativamente bajo de la fuerza electromotriz de las nanopartículas individuales.
Para los imanes permanentes, cuando la magnetización se concentra en el volumen V, la expresión integral se divide en dos integrales, a saber, el volumen y la superficie:
En el caso de una muestra con magnetización constante, la densidad de corriente es cero.Entonces, la expresión del vector de inducción magnética tomará la siguiente forma:
Utilice el programa MATLAB (MathWorks, Inc., EE. UU.) para cálculo numérico, licencia académica ETU “LETI” número 40502181.
Como se muestra en la Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura-10, el campo magnético más fuerte lo genera un imán orientado axialmente desde el extremo del cilindro.El radio de acción efectivo es equivalente a la geometría del imán.En los imanes cilíndricos con un cilindro cuya longitud es mayor que su diámetro, el campo magnético más intenso se observa en la dirección axial-radial (para el componente correspondiente);por lo tanto, un par de cilindros con una relación de aspecto mayor (diámetro y longitud) de adsorción de MNP es la más efectiva.
Fig. 7 El componente de la intensidad de inducción magnética Bz a lo largo del eje Oz del imán;El tamaño estándar del imán: línea negra 0,5 × 2 mm, línea azul 2 × 2 mm, línea verde 3 × 2 mm, línea roja 5 × 2 mm.
Figura 8 El componente de inducción magnética Br es perpendicular al eje del imán Oz;El tamaño estándar del imán: línea negra 0,5 × 2 mm, línea azul 2 × 2 mm, línea verde 3 × 2 mm, línea roja 5 × 2 mm.
Figura 9 El componente de intensidad de inducción magnética Bz a la distancia r del eje final del imán (z=0);El tamaño estándar del imán: línea negra 0,5 × 2 mm, línea azul 2 × 2 mm, línea verde 3 × 2 mm, línea roja 5 × 2 mm.
Figura 10 Componente de inducción magnética a lo largo de la dirección radial;Tamaño del imán estándar: línea negra 0,5 × 2 mm, línea azul 2 × 2 mm, línea verde 3 × 2 mm, línea roja 5 × 2 mm.
Se pueden utilizar modelos hidrodinámicos especiales para estudiar el método de administración de MNP a los tejidos tumorales, concentrar nanopartículas en el área objetivo y determinar el comportamiento de las nanopartículas en condiciones hidrodinámicas en el sistema circulatorio.Los imanes permanentes se pueden utilizar como campos magnéticos externos.Si ignoramos la interacción magnetostática entre las nanopartículas y no consideramos el modelo de fluido magnético, es suficiente estimar la interacción entre el imán y una sola nanopartícula con una aproximación dipolo-dipolo.
Donde m es el momento magnético del imán, r es el radio vector del punto donde se ubica la nanopartícula y k es el factor del sistema.En la aproximación dipolo, el campo del imán tiene una configuración similar (Figura 11).
En un campo magnético uniforme, las nanopartículas sólo giran a lo largo de las líneas de fuerza.En un campo magnético no uniforme, actúa sobre él una fuerza:
¿Dónde está la derivada de una dirección dada l?Además, la fuerza atrae las nanopartículas hacia las zonas más desiguales del campo, es decir, aumenta la curvatura y la densidad de las líneas de fuerza.
Por lo tanto, es deseable utilizar un imán (o cadena magnética) suficientemente fuerte con una anisotropía axial obvia en el área donde se encuentran las partículas.
La Tabla 1 muestra la capacidad de un solo imán como fuente de campo magnético suficiente para capturar y retener MNP en el lecho vascular del campo de aplicación.